「高圧蛍光実験からタンパク質の“隠れた構造”を探る」

■背景 私たちヒトを含めた生命体が織りなす複雑な生命活動は、多様なタンパク質が個々に与えられた役割を正確に果たすことで成り立っています。これまで、タンパク質の機能発現に重要なのはアミノ酸が連なっただけの“ひも”から自発的に折り畳まれて形成される最も安定な立体構造（天然構造）だとされ、盛んに研究が進められてきました。しかし近年、水溶液中のタンパク質は天然構造とそれよりも極めて低い割合で「僅かに存在する構造（中間構造や変性構造）」との間で熱力学的な平衡にあり、幅広い時間域あるいは構造空間の中で絶えず“かたち”を変えながら揺れ動いている（構造揺らぎとも呼ばれる）、というタンパク質の「動的な実体」が示されるようになってきました1。このようなタンパク質の構造動態における一般原理を理解するには、個々のタンパク質分子の構造安定性を把握し、構造揺らぎと機能発現の機構がどの様にリンクしているかを調べることが重要な研究テーマとなります。
そのための有効な方法の一つとして、タンパク質分子に内在する3種の芳香族アミノ酸（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）を蛍光プローブとする蛍光測定があります。通常は、最も強い強度を発するトリプトファン蛍光を観測対象としますが、トリプトファンを持たないタンパク質を調べる場合にはチロシンをプローブとして蛍光スペクトルを測定します。これらアミノ酸由来の蛍光スペクトルにはタンパク質全体の構造状態が反映され、物理パラメータ（温度・pHや圧力など）により化学平衡を変化させることで、例えばタンパク質の立体構造が消失していく、いわゆる“変性過程”に関する熱力学パラメータを見積もることができます2。特筆すべきはタンパク質に対する圧力の効果です。圧力で化学平衡を変化させると、温度軸では観測が難しい「僅かに存在する構造」への転移（構造揺らぎ）を分光学的に捕える事が可能となります2,3。圧力と蛍光測定を組み合わせた「高圧蛍光測定法」を通じてタンパク質の構造揺らぎがどの様に見えてくるのか、卵白アレルゲンタンパク質の研究3を例に紹介します。



図１　（左）チロシンはpHが塩基性側に傾くと平衡がずれ、側鎖OH基からH⁺が解離したチロシネートの濃度が増える。それに応じて蛍光スペクトルの最大蛍光波長λ_maxが304 nm（チロシン）から340 nm（チロシネート）へとシフトする。（右）アレルゲンタンパク質オボムコイドに圧力を加えると、内在性チロシンの蛍光強度（波長：304 nm）が減少し、同時にチロシネートの蛍光強度（波長：～340 nm）が増加してくる。これは加圧に伴う構造転移が生じた結果、チロシネートを持つ構造状態の割合が増えたことを示している。



図２　高圧蛍光実験から、卵白アレルゲンタンパク質オボムコイドには密に折り畳まれた天然構造と分子内への浸水と共に部分的に“かたち”が崩れた中間体構造との間の平衡が存在していることが明らかとなった。この様に、生理条件下ではごく僅かに存在しているものの“見えない構造”が、加圧に伴いその濃度が指数関数的に増大することで分光学的に検出できるようになる。

■研究概要 卵白の主要なアレルゲンとして知られるオボムコイドは、3つの独立したドメインで構成される28kDaのトリプシンインヒビターとして古くから研究対象とされてきました。その中で、特に第3ドメイン（Domain 3）が異常な構造安定性を示し、分解酵素による作用を受けにくいこと、そしてエピトープとなるアミノ酸配列が含まれていることが指摘されてきました。しかし、このアレルゲン蛋白質がどのような動的構造の特性（構造揺らぎ）を備えているのかについては殆ど研究されていませんでした。今回ターゲットとなるオボムコイドにはトリプトファン残基が存在しないため、分子内に6つ含まれるチロシン残基の蛍光をプローブに蛍光測定を行いました。チロシンはpHに依存して蛍光スペクトルの最大蛍光波長maxが変化します（図1左）。その物性をうまく利用して、分子内に埋もれたチロシン残基が何らかの理由で周囲の水と接触した場合に、側鎖OH基のH+が自発的に解離した様子がスペクトルに反映されるよう試料溶液のpHを塩基性に設定しました。
タンパク質試料に対して50気圧から7000気圧まで段階的に圧力を加えていくと、304 nmにおけるチロシン蛍光の強度が元の約1/3にまで減少し、その分チロシネートの蛍光強度が相対的に増加しました（図1右）。これは、チロシンを含む構造からチロシネートを含む構造への転移が加圧により生じたことで、3つ中2つのドメインにおいて分子内水和が進んだ中間体構造が安定的に検出できたことを示しています。最終的には、卵白アレルゲンタンパク質オボムコイドには密に折り畳まれた“天然構造”と第3ドメインを残して立体構造が崩れた“中間体構造”との間に平衡が存在していることが明らかになり（図2）、低アレルゲン化の実現が難しい理由の一つとして、アレルゲンタンパク質中のエピトープが異常に硬い構造部位に存在することで酵素分解から保護されていることが示唆されました。

■科学的・社会的意義 通常の実験法では見えない“隠れた構造”を探り、タンパク質の動的構造における一般則の理解を進めていくことは、構造と機能の相関を知ることに留まらず、例えば病気に関わるタンパク質の物性や動的構造の情報に基づく治療法の開発などに繋がる可能性がある。

■参考文献 １）High Pressure Bioscience - Basic Concept, Applications and Frontiers. Springer, eds. K. Akasaka and H. Matsuki, Sub-cellular biochemistry (2015).
２）Maeno, A. et al. (2009) “The pressure-temperature phase diagram of hen lysozyme at low pH.” BIOPHYSICS 5:1-9.
３）Maeno A. et al. (2013) “Tyrosine/tyrosinate fluorescence at 700 MPa: A pressure unfolding study of chicken ovomucoid at pH 12.” Biophys. Chem. 183:57-63.

■良く使用する材料・機器 １） 分光蛍光光度計　FP-6500　（日本分光株式会社）
２） 高圧蛍光測定用耐圧チャンバー　（株式会社シン・コーポレーション）
３） 実験試薬（和光純薬工業株式会社、ナカライテスク株式会社）

H29年度分野別専門委員
関西医科大学医学部　化学教室
前野 覚大　（まえのあきひろ）
https://www.kmu.ac.jp/medical/2671t80000001bjt.html

「蛍光で、生体分子の状態、構造変化、結合を捉える」

■背景 蛍光は、照射された光を蛍光色素が吸収して励起状態になり、さらに基底状態へ戻る過程で起こる発光です。以下に説明するように、蛍光の特性を利用した様々な蛍光測定によって、タンパク質、核酸、生体膜などの生体分子の研究が行われています。
生体分子の研究に使われている蛍光色素としては、生体分子に本来含まれる内部色素と、実験者が人為的に外部から実験系に導入する外部色素があります（図1）。内部色素としては、タンパク質に多く含まれる芳香族アミノ酸であるトリプトファン、そして細胞内に含まれる補酵素であるNAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）などが挙げられます。外部色素としては、ピレン、フルオレセイン、ローダミン、そしてCy3などがしばしば使われています。外部色素は、内部色素では得られない情報を得るためや、内部色素よりも高感度な測定を行うために使用されます。
蛍光発光について少し詳しく見てみましょう。図2には、蛍光色素の一例としてローダミン6Gの励起スペクトルと蛍光スペクトルを示しています。蛍光色素に照射する単色光（励起光）の波長に対する蛍光の強度の関係を示すのが励起スペクトルであり、蛍光色素が発生する蛍光の波長に対する強度分布が蛍光スペクトルです。また、図3には蛍光色素が光を吸収してから蛍光発光するまでの過程を示しています。励起光を吸収した蛍光色素は、10^-15秒で基底状態(S₀状態)から励起状態へ遷移します。次いで、励起状態の色素は、エネルギー的に最低の励起状態(S₁状態)へ、10^-11秒で緩和します（分子内緩和）。最後に、このS₁状態から基底状態S₀へ10^-9秒（ナノ秒）で遷移します。この遷移には、蛍光発光する場合（輻射遷移）、あるいは蛍光発光しない場合（無輻射遷移）の両方が確率的に起こります。この一連の過程では、励起状態S₁から基底状態S₀への遷移がナノ秒程度の時間が掛かる律速段階で、このステップに掛かる時間を蛍光寿命といいます。
生体分子の研究における蛍光測定では、蛍光の強度、スペクトル、偏光、あるいは過渡蛍光減衰（蛍光寿命）を測定します。また、測定には、定常蛍光測定装置や時間分解蛍光測定装置を使用します（図4）。定常蛍光測定装置は、一定強度の励起光を使い、蛍光色素が発生する蛍光を測定するものです。これによって、蛍光強度、定常蛍光偏光度、そして蛍光スペクトルを測定します。時間分解蛍光測定装置は、パルス光や、連続光の強度を高周波数(1 MHz～数100 MHz)で変化させた強度変調光を励起光として用いて蛍光を測定するものであり、蛍光寿命、時間分解蛍光偏光解消（回転相関時間）、そして時間分解蛍光スペクトルを測定することができます。また、研究者が独自に工夫を凝らした蛍光測定装置を自作し、生体分子の研究に使っているケースもあります。
次節では、生体分子の研究における蛍光測定の応用例について説明します。なお、本ページ以外にも、「1分子イメージング」、「蛍光顕微鏡」、「分子計測・微小操作」等のページに蛍光の関連情報がありますので、併せてご覧下さい。

図１　蛍光色素の例。

図２　ローダミン6Gの励起スペクトルと蛍光スペクトル。

図３　蛍光色素の励起から蛍光発光までの過程の模式図

図４　蛍光測定装置。(a)定常蛍光分光測定装置。SPEX社製、Fluorolog-2。(b)時間分解蛍光測定装置。堀場製作所製、TemPro。

図５　ピレンを使ったアクチンの重合の測定。(a)アクチン重合の模式図。(b)アクチンにおけるピレン標識部位とその部位の構造。(c)ピレンのアクチン重合に伴う蛍光スペクトル変化。

図６　蛍光偏光および蛍光偏光解消測定。(a)蛍光偏光、蛍光偏光解消の模式図。なお、１回の光吸収・励起～基底状態への帰還のサイクルで発生する蛍光光子の数は、１個の色素あたりで量子収率に相当し、1個に満たない。したがって、このパネルの右側に示した蛍光偏光については、あくまでも平均値を模式化したものである。(b)アクチンに結合したCy3の蛍光スペクトル。(c)アクチンに結合したCy3の定常状態蛍光異方性。(d)時間相関単一光子計数法によるCy3の蛍光寿命測定。(e)定常状態異方性および蛍光寿命から算出されたCy3の回転相関時間。

図７　蛍光エネルギー移動測定。(a)蛍光エネルギー移動の距離依存性の模式図。(b)シトクロムcの構造変化測定のための蛍光標識部位。テトラメチルローダミンをCys102に導入した。テトラメチルローダミンからヘムへの蛍光エネルギー移動を測定する。ヘムは蛍光を発生しないので、蛍光エネルギー移動はテトラメチルローダミンの蛍光強度現象として計測される。(c)酸性条件(pH 2.4)における、シトクロムcに結合したテトラメチルローダミンの蛍光強度の塩濃度依存性。(d) シトクロムcに結合したテトラメチルローダミンの蛍光強度のpH依存性。

■研究概要 定常蛍光測定装置や時間分解蛍光測定装置によって測定されるデータの種類には、主として

●蛍光強度、スペクトル
●蛍光偏光
●蛍光寿命
●蛍光エネルギー移動

があります。これらは、それぞれの特徴を生かして、生体分子の研究に利用されています。特に、タンパク質の蛍光標識に用いられる多くの蛍光色素の分子量は約100～1000であり、サイズもタンパク質（分子量は、典型的には10000以上）よりもずっと小さいです。このため、タンパク質の特定部位に蛍光色素を結合することによって、タンパク質分子内や分子間で起こる様々な変化を検知するセンサーあるいはプローブ(probe)として使うことが広く行われています。この意味で、生体分子の研究に用いる蛍光色素のことを「蛍光プローブ」と呼んでいます。以下では、タンパク質の研究における蛍光測定の実施例を説明します。

(1) 微環境や状態の変化を検出する：蛍光強度と蛍光スペクトル
蛍光色素からの蛍光の強度やスペクトルは、蛍光色素周囲の微環境を検知するシグナルになります。すなわち、蛍光強度や蛍光波長は、色素と相互作用する官能基、色素と接触する溶媒の種類、色素周囲の媒体の誘電率や粘性、あるいは色素周囲の温度などに応答して変化します。こういったことから、タンパク質に結合した蛍光色素からの蛍光強度や蛍光スペクトルの測定でタンパク質の状態変化を検出することが行われています。
図5には、筋肉や細胞骨格の主要タンパク質のひとつであるアクチンの例を示しています。アクチンは、1個1個が解離したG状態と、アクチン分子同士が自己集合してフィラメントを形成するF状態をとります。アクチンの374番目のアミノ酸残基であるシステイン（Cys374）をピレンという蛍光色素で標識し、ピレンの蛍光を測定します。アクチンのG状態、F状態では、Cys374周囲の微環境が異なりますので、ピレンの蛍光強度や蛍光スペクトルによって、アクチンのG状態、F状態を検出することができます。

(2) 角度変化や回転ブラウン運動を測定する：蛍光偏光、蛍光偏光解消
蛍光色素の励起、そして蛍光発光には指向性があります。この指向性を利用することで角度変化や、回転ブラウン運動を測定するのが蛍光偏光測定です。光のもつ電場振動の向きが一方向にそろった光を直線偏光といいます。直線偏光の励起光に対して、励起しやすい蛍光色素の向きがあります（吸収遷移双極子）。また、色素の蛍光にも発生しやすい向きがあります（蛍光遷移双極子）。直線偏光の励起光で蛍光色素を励起し、発生した蛍光の偏光度（蛍光異方性）を測定することで、蛍光色素の角度や回転ブラウン運動を測定することができます（図6）。
私たちの研究グループでは、蛍光偏光測定によって、アクチン周囲の局所粘性を調べる研究を行いました（図6）。色素の回転ブラウン運動は、その周囲の粘性が高いと遅く、低いと速くなります。また、蛍光色素が励起してから蛍光発光するまでの時間（蛍光寿命）は10^-9秒程度あり、蛍光色素を蛍光寿命という動作時間をもつタイマーとして利用します。蛍光色素を直線偏光で励起し蛍光異方性測定をすることによって、回転ブラウン運動によってナノ秒の間におこる色素の角度変化を算出することができます。アクチンのCys374をCy3という蛍光色素で標識し、Cy3の定常蛍光偏光および蛍光寿命の測定からCy3の回転ブラウン運動を算出したところ、アクチンがG状態よりもフィラメントを形成したF状態においてCy3の回転ブラウン運動が速いという結果を得ました。この結果より、Fアクチン周囲には純水よりも粘性の低い水和水の層が存在していることが示唆されました。

(3) 距離測定や、2個の色素の近接・遠隔の検出：蛍光エネルギー移動
蛍光エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET）は、2個の色素が近接（距離＜約10 nm；1 nm = 1/10⁹ m）したとき起こる色素間の相互作用です。蛍光エネルギー移動は、励起光の照射により第1の蛍光色素（ドナー、供与体）が励起され、励起状態のドナー色素から第2の色素（アクセプター、受容体）へ励起エネルギーが移動するものです。FRETに伴って、ドナー色素の蛍光強度が低下し、アクセプターが蛍光色素の場合はアクセプターの蛍光発光が起こります（図7）。FRETの効率E_Tは、ドナー色素・アクセプター色素間の距離の関数となることが知られています：



ここで、Rは色素間距離、R₀はFörster距離と呼ばれる定数です。Förster距離は、ドナーの蛍光スペクトル、アクセプターの吸光スペクトル、そして両色素間の相対的な配向などで決まり、多くの色素ペアで約5 nm以下であることがしばしばです。FRET効率は、蛍光強度・蛍光スペクトル測定あるいは蛍光寿命測定から算出することができます。
ドナー・アクセプター同士が近接するとFRET効率は高くなり、遠ざかると低くなります。さらに、Förster距離がナノメーターオーダーであること、つまりFRETがタンパク質のサイズ程度の距離で起こるものであることから、タンパク質分子中の2点間距離や距離変化の測定にしばしば使われます。また、ドナー・アクセプター同士が極至近距離に近接したときのみFRETが起こることから、（FRETのドナー、アクセプターで標識した）タンパク質とリガンドとの間の相互作用検出にも良く使われます。
図7に示したのは、酵母シトクロムcの102番のシステイン残基(Cys102)を蛍光色素テトラメチルローダミン(TMR)で標識して行った測定例です。TMRとシトクロムcの補欠分子族であるヘムとの間でFRETが起こります。このペアでは、Förster距離は1.2 nmです。ヘムは蛍光発光のない色素であり、FRETが起こるとドナー色素であるTMRの蛍光の低下として検出されます。シトクロムcが天然状態の時は、Cys102とヘムとの距離は0.5 nmでFRET効率は非常に高くなり、したがってTMRは低い蛍光強度を示しました。一方、酸性pHにおいてシトクロムcを変性させると、TMRとヘムが遠ざかることによってFRET効率が低下してTMRの蛍光が増大し、一方、酸変性したシトクロムcに塩を加えてモルテングロビュール状態にすると再びFRET効率が増加することによってTMRの蛍光強度が低下しました。このように、FRETは、タンパク質の構造変化の検出に有用です。

■科学的・社会的意義 以上で一端を紹介したように、生体分子の状態、構造変化、結合を調べる手段として、蛍光測定は有用な研究手段です。新たなタンパク質が次々と発見されている昨今、今後の光測定の技術の進歩や、新規蛍光プローブの開発などを伴うことにより、様々なタンパク質の機能・構造を調べる手段として蛍光測定の応用の裾野は広がっていくものと期待されます。

■参考文献 １）御橋廣眞（編） (2006) 蛍光分光とイメージングの手法 (日本分光学会測定法シリーズ)、学会出版センター
２）Joseph R. Lakowicz (2006) Principles of fluorescence spectroscopy, 3rd Ed, Springer.
３）Wazawa, T., Sagawa, T., Ogawa, T., Morimoto, M., Kodama, T., Suzuki, M. (2011) Hyper-mobility of water around actin filaments revealed using pulse-field gradient spin-echo 1H NMR and fluorescence spectroscopy. Biochem. Biophys. Res. Commun. 404:985 990.

■良く使用する材料・機器 １）定常蛍光分光測定装置（株式会社堀場製作所、日本分光株式会社、株式会社島津製作所）
２）時間分解蛍光測定装置（株式会社堀場製作所、浜松ホトニクス株式会社、株式会社日本レーザー、株式会社東京インスツルメンツ）
３）蛍光試薬（和光純薬株式会社、ナカライテスク株式会社、GEヘルスケア・ジャパン株式会社、株式会社同仁化学研究所、ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）
４）光検出器（浜松ホトニクス株式会社、アンドール・テクノロジーPLC、株式会社日本ローパー、松定プレシジョン株式会社）
５）光学部品（シグマ光機株式会社、ソーラボジャパン株式会社、朝日分光株式会社）
６）分光器（アンドール・テクノロジーPLC、株式会社日本ローパー、株式会社堀場製作所、分光計器株式会社）
７）蛍光測定用キュベット（東ソー・クォーツ株式会社）

H25年度分野別専門委員
東北大学大学院工学研究科材料システム工学専攻
和沢鉄一　（わざわてついち）